2025-12-22 01:07:23

🔥 同源重组法构建质粒

同源重组法构建质粒的步骤如下：

1、根据目的片段的酶切位点，选择响应的内切酶，通过双酶切法将环状载体质粒切割成线性化载体，用琼脂糖凝胶法回收酶切产物，回收方法按照试剂盒操作。

2、用 PCR 法扩增目的片段的序列，用琼脂糖凝胶法回收扩增产物。

3、将线性化的载体与扩增的片段按比例进行连接，37 ℃，30 min 或更长时间（1~2 h）。将连接好的重组质粒（10 μl）转入克隆感受态细胞 DH5α，轻轻吹打均匀，切勿振荡混匀，冰上静置 30 min，然后 42 °C 水浴热激 90 s，立即置于冰上静置冷却 2~3 min。

4、加入 500 μl 不添加抗生素的 LB 液体培养基，37 ℃ 摇菌 1 h， 转速 250 rpm。

5、将上一步的菌液 5 000 rpm 离心 5 min，弃掉 300 μl 上清。用剩余培养基将菌体重悬，最好按不同梯度涂板，防止单克隆菌过密或过疏，用无菌涂布棒在含有质粒抗性的平板上涂匀后，置于 37 ℃ 培养箱中培养 10~12 h。

6、过夜后，用 1 μl 枪头挑单克隆菌，置于 5 ml 的含抗生素的 LB 液体培养基中，继续培养 10~12 h。

7、质粒小提试剂盒提取菌液中的重组质粒后，用限制性内切酶消化后，进行琼脂糖电泳做酶切鉴定。

8、第 7 步的同时，可以吸取部分菌液做菌液 PCR，PCR 产物琼脂糖凝胶电泳看条带大小，进一步鉴定重组质粒是否正确。

9、将鉴定成功的菌液送测序公司进行双向测序，待序列结果比对正确后，表示重组质粒构建成功，可以进行下游实验。